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上海卡努生物科技有限公司
发布时间:2018-10-23 17:52浏览次数:

  的情况下,PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出,实现检测结果的定性分析。

  注:阴性对照为人基因组DNA,阳性对照为失去活性的乙型流感病毒cDNA。

  【储存条件及有效期】避光-20℃以下保存,避免反复冻融,有效期12个月。

  (1)鼻拭子: 操作者将沾湿的无菌拭子平行于上腭的角度轻轻地左右转动从一侧鼻孔插入至鼻道内鼻腭处,一般当拭子插入有阻力时再将拭子停留2~3s后缓慢转动退出。

  (2)咽拭子:操作者一手持压舌板压住病人舌后根,另一手拿住无菌拭子根部,然后将沾湿的无菌拭子左右两面及拭子头部快速且较用力地分别刮取扁桃腺两侧及咽后壁的分泌物。

  标本收集后可立即检测;若不能立即检测,可置于2~8℃冷藏过夜保存;如需长期保存,标本应冻存于-80℃以下,避免反复冻融。

  (1)从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂,充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。

  (2)核算当次实验所需要的反应数(n),并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。

  n =阴性对照数(1T)+阳性对照数(1T)+误差预留量(1T)+样本数

  (3)在无菌离心管中加入上述试剂,充分混匀后瞬时离心。按照20 L/管分装量将试剂分装至PCR反应管。

  用QIAGEN、Roche公司RNA提取试剂盒提取RNA,具体操作按照其试剂盒说明书操作。

  在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本RNA各5 l、终体积25 l/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5 L试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品,终体积为25l/管,盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心,转移到PCR仪器上。

  (1)取样本处理区准备好的PCR反应管,放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置,并记录放置顺序。

  注:ABI系列荧光PCR仪在设置时不选ROX校正,设置淬灭基团选择None。

  (1)阳性对照:有典型S型扩增曲线或无Ct值,线形为直线或轻微斜线,无指数增长期。

  标本检测结果Ct值在35~38范围内。此时应对标本进行重复检测,如重复实验结果Ct值仍在35~38范围内,有明显指数增长期,则判定为阳性,否则为阴性。(3)阴性:标本检测结果Ct值>38或无Ct值。

  当检测样本中被检核酸浓度低于本试剂盒的zui低检出限时可能会发生假阴性的结果。

  整个检测过程应严格按照本说明书要求分别在试剂准备区、样本处理区和PCR扩增区进行操作,各区实验服、仪器、耗材应独立使用,不能混用;实验用吸头采用带滤芯吸头;样本处理区应配有生物安全柜,样本处理在生物安全柜中进行操作;三个区应该配有紫外线杀菌装置。2.为避免RNA降解,样本处理过程应在0-4

  ℃条件下操作,且完成实验后立即上机检测;样本处理过程中使用的器具耗材应经过无核酶处理。3.

  试剂盒内所配阴性和阳性对照在*次使用前应全部转移至标本准备区,并单独存放。6.为防止荧光干扰,应避免裸手直接接触PCR反应管,并应避免在PCR反应管上进行任何标记。

  不同批号试剂不能混用。8.ABI系列荧光定量PCR仪参数设置中不选ROX校正,淬灭基因选择None。

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